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          食品中呋喃妥因代謝物酶聯免疫檢測試劑盒的研制

          [ 更新時間:2013-08-19 ]

           

          食品中呋喃妥因代謝物酶聯免疫檢測試劑盒的研制
           
          摘要:目的 開發研制快速檢測呋喃妥因代謝物的酶聯免疫檢測試劑盒。方法:依據直接競爭ELISA原理,采用包被法確定最佳抗體包被濃度和酶標抗原工作濃度、包被條件、反應時間、底物顯色時間等,并對試劑盒的各項技術指標進行確認。結果:成功的組裝了呋喃妥因的酶聯免疫檢測試劑盒,并建立了肌肉、肝臟、水產、蜂蜜等的前處理方法,檢測限均遠低于lug/kg。該試劑盒線性檢測范圍為0~4.05ng/mL,IC50浮動范圍0.30~0.60ng/mL,樣品的板內、批內、批間的變異系數均小于15%,平均回收率在65%~90%之問,與其同類藥物的交叉反應率均小于0.2%。結論:本研究研制的試刺盒重復性、再現性、特異性、穩定性各項指標均符合技術要求,可用于動物源性食品中呋喃妥因代謝物殘留的檢測。
          關鍵詞:食品;呋喃妥因;酶聯免疫
          呋喃妥因(Nitrofurantoin)以及呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃它酮Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃類抗生素因其廣譜、高效、廉價等特點被廣泛應用于家畜、家禽、水產、蜂等動物傳染疾病的預防和治療。硝基呋喃類藥物在動物體內很快代謝,1一氨基一乙內酰脲(AHD)是呋喃妥因的代謝物,其內服后隨尿液大量排出,臨床上主要用于敏感菌所致的泌尿系統感染,但此類藥物及其代謝物具有很強的毒性,其在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類,長期攝入有致畸胎、致癌等副作用。美國、日本和歐盟目前已全面規定禁止使用呋喃類抗菌物質,在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。我國農業部文件農牧發[200211號也規定動物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的檢出限為不得檢出。
          目前用于檢測硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的方法主要有HPLC、LC—M/MS和酶聯免疫法(EUSA)等。其中HPLC和LC—MS/MS靈敏度高、準確性好,常作為藥物殘留檢測的確認方法,在我國LC—MS/MS技術更是被作為此類藥物在動物源性食品中檢測的國標法。然此類方法對儀器和操作人員要求都較高,一個樣品檢測要幾百元,檢測時間也很長,不能
          滿足現場抽檢的需求和推廣應用。ELISA技術以其快速、靈敏、特異性高等特點已成為目前藥品殘留檢測的有效方法之一。應用酶聯免疫技術檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘
          留近幾年來取得了少許成果,Chang C等采用ELISA測定可食性動物組織中呋喃唑酮代謝物,抑制率(Ic )可達到0.91mg/L,回收率55.8% ~99.6%;蝦類中喃唑酮代謝物殘留ELISA篩選方法。他們在酸性條件下利用2一硝基苯甲醛衍生化,乙酸乙酯提取,正己烷去雜質后進行ELISA分析。其最低檢測限為0.3tLg/kg,向樣品中添加濃度為0.5、1.0和3.01xg/kg 3個梯度標準品溶液時,平均回收2率范圍為90.7% ~95.9%。目前,國外也已經開發出檢測呋喃妥因等代謝物的ELISA商品化試劑盒。但其價格昂貴,價格均在4000元,盒以上。國產呋喃妥因殘留檢測試劑盒質量和性能都不夠穩定,市場化范圍qE4",。本研究擬采用酶聯免疫一步分析法,研制出可以在短時間內大量定量分析檢測水產、蜂蜜、畜禽等生物樣本中AHD的試劑盒。
          1 材料和方法
          1.1 材料與儀器AHD等標準品(Sigma公司,純度>99%);HRP購自美國IDS公司;TECAN Genios Basic酶標儀;樣品稀釋工作液;ELISA試劑(包被液、封閉液、酶標記物稀釋液、終止液、濃縮洗滌液);其它化學試劑均為國產分析純。
          1.2 方法
          1.2.1 AHD抗血清效價的測定呋喃妥因抗血清采購自美國IDS公司。采用直接ELISA法進行測定。酶標反應板包被抗呋喃妥因抗血清、洗滌、封閉,并以同樣的稀釋度的陰性血清為對照,第1行1~12孔依次加入倍比稀釋的呋喃妥因過氧化合物酶結合物(購自美國IDS公司),均為IO0uL/孔,22~23℃溫育10min;再加入辣根過氧化物酶(ARP)底物(購自美國
          IDS公司)lO01~ld孔,經過10min孵育,終止反應后測定OD450值??寡宓腛D450值與相同稀釋度的陰性血清0D450值之比大于2的最大稀釋度定為呋喃妥因抗血清的效價。
          1.2.2 EUSA方法的建立   呋喃妥因抗血清的效價確定之后,依次通過對半抑制濃度(IC )值、最大吸光度值進行比較確定最佳抗體包被濃度和酶標抗原工作濃度、包被條件、反應時間、底物顯色時間等。以AHD濃度( g/L)的自然對數值為x軸,百分吸光率B/BO(B為添加藥物時的吸光值,B0為不添加藥物時的吸光值)為Y軸,繪制曲線圖。
          1.2.3 AHD標準曲線的建立根據1.2.2節得到的最佳ELISA方法條件,選擇合適的抗原抗體含量及不同濃度梯度的AHD標準品(O、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ppb)進行一步
          法直接競爭ELISA,以AHD標準品濃度(ng/mL)的自然對數值為x軸,百分吸光率B/B0為Y軸,得到線性及靈敏度較高的呋喃妥因標準曲線。
          1.2.4 樣品前處理方法的建立   對于組織(肌肉、肝臟、水產等)取適量供試樣用均質器均質樣本,避免出現有高脂肪、血管等物質,取1.0±0.05g的均質物進行以下操作;對于蜂蜜樣品直接稱取1.0±O.05g的供試樣進行一下操作:
          (1)衍生化
          加人4mL蒸餾水,0.5mL 1M 鹽酸和150 L 50mM的4一硝基苯甲醛溶液;渦旋混勻30s,60%水浴3h,每隔1h渦旋振蕩一次。
          (2)提取
          加人5mL 0.1M 磷酸氫二鉀和0.4mL 1M氫氧化鈉溶液,混勻加入6mL乙酸乙酯,劇烈振蕩60s以上;室溫條件下,4000g離心10rain;收集3mL的上層乙酸乙酯至10mL玻璃試管(不能使用塑料管),50~60%水浴氮氣吹干。
          (3)凈化
          加人lmL正己烷,渦旋混勻30s,然后加入lmL樣品稀釋工作液復溶,振蕩混勻30s(組織樣本此過程中一定要注意防止乳化);室溫條件下3000g離心5min完全棄去上層有機相,取下層水相取50 L用于分析。對于飼料樣品,稱取1.0±0.05g粉碎的樣本加入lOmL乙腈,65℃超聲波提取15min,室溫下4000rpm離心10min;取上清液2mL,于50~60%水浴環境中氮氣吹干;加入lmL樣品稀釋工作液溶解干燥物。充分混勻后用樣品稀釋工作液再做1O倍稀釋,取50 L用于分析。
          1.2.5 試劑盒各項技術參數的確定
          (1) 試劑盒靈敏度實驗
          評價競爭性酶聯免疫吸附實驗反應靈敏度的方法,常用的有Ic 和檢測限(下限)。分別測定20次標準曲線的Ic,確定該值的浮動范圍。一定條件下,試劑盒方法檢測限符合
          正態分布的規律,取肌肉、肝臟、水產、蜂蜜20個空白樣本通過試劑盒測定的光密度在標準曲線上對應的AHD含量的平均值(x)和標準差(s)表示,檢測限=X+3S。
          (2) 試劑盒重復性和再珊I生實驗
          重復性即實驗室內的變異程度。以蜂蜜樣品為例,將空白樣品以定量限0.5 g/kg、兩倍定量限1 g/kg進行添加,每個濃度各5個平行,并抽取3批試劑盒,每批試劑盒測定
          同一份樣品3次,分別計算測定樣品板內、批內和批間平均回收率,得到樣品的變異系數和回收率范圍。再現性即實驗室間的變異程度。對同一魚肉樣品,分別在不同地點的實驗室對隨機抽取的同一批次的3個試劑盒進行添加實驗,計算其平均回收率和變異系數。
          (3) 試劑盒特異性實驗
          試劑盒的特異性可用藥物的交叉反應率來表示。交叉反應率即引起50%抑制的標準物濃度與類似物引起50%抑制的濃度值之比。本實驗分別測定了該試劑盒與呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等原型藥及其代謝物的交叉反應率。
          (4) 試劑盒穩定性實驗
          采用冷熱性加速實驗確定試劑盒的穩定性。將三批試劑盒置于37℃恒溫箱中1d、3d、6d,隨機取6盒試劑盒檢測相關技術指標。從3批試劑盒中抽出6個試劑盒,每盒均做4℃ 6個時間段(第0、1、2、3、6、7月)的保存試驗。每個時間點分別取出1個試劑盒,每個試劑盒做5條曲線、5個樣品重復,測定其Ic 抑制濃度(靈敏度)、檢測限、標準品板內變
          異系數和回收率等相關技術指標。
          2 結果
          2.1 AHD抗血清效價的確定   經測定AHD抗血清的效價為1000。
          2.2 AHD抗體包被濃度和酶標抗原工作濃度的確定   通過滴定法對Ic 值、最大吸光度值和樣品添加回收率的比較,確定抗體的包被濃度和酶標抗原的工作濃度。
          隨著包被抗AHD抗血清濃度的降低,最大吸光值降低,Ic 值在一定范圍內也隨之降低。經測定包被抗血清按1.50×10 倍稀釋,其Ic 濃度、回收率和吸光度值均較好。因此,選擇1.5 x 10 倍稀釋的包被抗血清進行包被。AHD酶標物在2.5×10 倍稀釋時,最大吸光度值、IC 一直濃度和樣品測定結果均處于最佳狀態。3.0 x 10,倍稀釋時,吸光度降低以及本底干擾增加。所以酶標抗原濃度選擇以試驗研究2500倍稀釋相對較好。
          2.3 包被條件的確定   用包被液將抗AHD抗血清稀釋至最適工作濃度,每孔100It,L,分成3組。第一組:37℃溫育lh;第二組:37。c溫育2h;第三組:4℃溫育24h。綜合3組數據結果,選擇最大吸光值較大,Ic 較低,添加回收率較高的包被條件作為試劑盒的包被條件;37%溫育2h,最大吸光值和IC 比較好,故選擇該包被條件。
          2.4 反應時間的確定   加入標準品溶液和酶標抗原溶液后分另 擁10min,30min,60min,結果見表5。樣品與酶櫪就原與抗血清反應時間為30min后,樣品中的AHD能充分與酶標抗原競爭結合酶標板上的已包被的抗血清的有效位點,再加入底物顯色液,可以提高反應的靈敏度并且最大吸光度值也比較好;而反應lOmin,加人底物顯色液,其吸光值較低,易出現樣品測定結果不準確現象;其次反應60min,最大吸光值偏高。
          2.5 底物顯色時間的確定   加入底物溶液后,22 23%條件下顯色5min、10min、20min。底物液顯色時間若較短(5min),則吸光值較低,對加終止液的時間要求更短,否則會出現實際值與真實值直接的差異。20min,吸光度值較高,對Ic 有輕微影響,且增加了整個操作時間。顯色10min,曲線和實際樣品測定均符合要求。其吸光度值域Ic 值均較好,故選用其作為試劑盒的顯色反應時間。
          2.6 試劑盒的組裝   經反復實驗,成功組裝了AHD一步法ELISA試劑盒,包括:酶標板1塊(12條X 8孔,可拆分);酶標物1瓶(濃縮液10 X:1.2mL); 酶標物稀釋液1瓶(13mL);樣品稀釋液5×1瓶(4OraL);清洗液10 X l瓶(50mL);顯色劑1瓶(13mL);終止液1瓶(13mL);AHD標準品6 x lmL/管(Ong/mL,0.05ng/mL,0.15 ng/mL,0.45 ng/mL,1.35 ng/mL,4.05 ng/mL);4一硝基苯甲醛75.5mg。
          2.7 試劑金各項技術參數的確定
          2.7.1 試劑盒靈敏度的確定統計Ic 二十次測定結果,Ic50 平均值為0.47ng/mL,浮動范圍在0.30—0.60ng/mL之間。經試驗確定樣品中AHD代謝物最低檢出限為0.3ug/kg(組織樣品);樣本中原型藥最低檢測限為5Oug/kg(飼料)。該檢測限能滿足歐盟的1ug/kg的最低檢測限量的要求。
          2.7.2 試劑盒重復性和再現性的確定 對蜂蜜樣1.0 ug/kg、2.0 ug/kg兩個濃度的AHD進行添加,測定變異系數,樣品的板內變異系數為1.7% ~9.86%之間,批內、批間變異系數均小于15%,樣品的平均回收率在65%一90%之間。對同一魚肉樣品,分別在不同地點的實驗室對隨機抽取的同一批次的3個試劑盒進行添加實驗,計算得到的加標平均回收率分別為88%、76%和85%,板問、批內和批間變異系數均小于15%,說明此試劑盒再現性良好。
          2.7.3 試劑盒特異性的確定   本試劑盒檢測結果顯示,AHD與其同類的呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林等及其代謝物的交叉反應率均小于0.2%。表明該試劑盒適用于食品中呋喃
          妥因類藥物的殘留檢測,具有良好的特異性。
          2.7.4 試劑盒穩定性的確定 冷熱穩定性實驗結果顯示:該試劑盒在37℃經6d的保存試驗,OD值有所下降,但零標準吸光度值仍在1.0以上。Ic 均在0.30~0.60ng/mL之間,陽
          性回收率在67.7% 一102.7%;標準品板內變異系數在15%以下。試劑盒保存條件為2—8℃ ,經過近7個月的測定,發現試劑盒從生產之起到第6個月,各項指標均符合《農業部文件》農醫發r[2oo5] 17號附件2試劑盒備案參考評判標準的規定。到第7個月時檢測結果發現0標準吸光度值在1.4左右,陽性樣品回收率有下降趨勢但幅度不是很大。
          3 討論
          本研究針對呋喃妥因代謝物(AHD),依據一步法直接競爭性ELISA原理,在組裝試劑盒時,采用棋盤法確定最佳抗體包被濃度和酶標抗原工作濃度,選著合適的抗原抗體反應緩沖液,從而達到了很好的競爭抑制效果。本研究建立了肌肉、肝臟、水產、蜂蜜等的前處理方法,檢測限均遠低于lug/kg。線性檢測范圍為0~4.05ng/mL,IC50平均值浮動范圍在0.30~0.60ng/mL之間,樣品的板內變異系數為1.7%~9.86%之間,批內、批間變異系數均小于15%,樣品的平均回收率在65%~90%之間,與其同類藥物的交叉反應率均小于0.2%,重復性、再現性、特異性、穩定性各項指標均符合要求。
          綜上所述,本研究建立的呋喃妥因及其代謝物直接競爭ELISA檢測試劑盒各項技術指標均符合要求,本試劑盒操作簡便、靈敏度高、穩定性好、檢測時間短,適用于大量樣品中呋喃妥因殘留檢測的快速篩選,為食品中非法添加呋喃妥因造成的食品安全問題提供了可靠的技術保障。
           
           

          本文內容摘自于“畜牧獸醫科技信息 試驗研究”2012年第7期

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